Новости

 
03 сентября 2019 г.

Предложив милейшему медленному лори сходить в бар, вы с удивлением узнаете, что... Нет, это не начало какой-то выдуманной истории, просто это чудесное создание не прочь налечь на что-нибудь покрепче. Неужели у лори был неудачный день на дереве, или же это вполне обоснованный выбор? Сейчас мы и разберемся.

Ничто в биологии не имеет смысла, кроме как в свете эволюции. Так, и тяга к такому противоречивому напитку, как алкоголь, имеет под собой вполне адекватную почву. Может быть, в какой-то момент стало выгодно потреблять такой хороший источник «быстрой» энергии, как этанол? Или же у наших предков просто не было выбора — умей метаболизировать ядовитый спирт или переставай кушать сладкие фрукты. Но когда же именно возникла способность усваивать этанол и можем ли мы извлечь из этой информации какую-либо практическую пользу? На эти вопросы можно ответить, изучив молекулярную эволюцию ферментов, участвующих в метаболизме спиртов.

Молекулярная эволюция — процесс изменения биомолекул (ДНК, РНК, белков) в череде поколений живых организмов. Изучение молекулярной эволюции тесно связано с такими дисциплинами, как палеонтология, генетика, молекулярная биология, математика и информатика. На основании данных о молекулярной эволюции можно построить филогенетическое дерево, наглядно показывающее степень родства между разными организмами, моменты появления и изменения определенных признаков и т.д.

Коротко о метаболизме этанола

Для начала необходимо понять, происхождение каких ферментов нам предстоит рассмотреть. Для этого коротко опишем метаболизм этанола в норме.

Усвоение этанола у человека начинается прямо в слизистой желудка при участии фермента АДГ4 (НАД+-зависимой алкогольдегидрогеназы 4 класса), причем вклад этого процесса является достаточным для того, чтобы считать его частью пресистемного метаболизма этанола.

Следующий и основной этап — окисление этанола в печени. За это ответственна АДГ1 со всеми ее изоформами (альфа, бета и гамма), способными образовывать гомо- и гетеродимеры, в форме которых они и проявляют свою активность.

Существуют также и другие окисляющие этанол ферменты: изофермент Р450 II E1, играющий значительную роль только при хроническом алкоголизме, и каталаза, расщепляющая только около 2% алкоголя.

Сама реакция в упрощенном виде выглядит следующим образом — рисунок 1.

Схема метаболизма этанола

Рисунок 1. Схема метаболизма этанола при помощи цитохрома P450 II E1, каталазы и АДГ. На данный момент у человека идентифицировано целых 5 классов АДГ и три изоформы АДГ первого класса. Номенклатура основывается на гомологии аминокислотных последовательностей, каталитических свойствах ферментов и содержании мРНК, кодирующей АДГ, в различных органах и тканях. Субстратная специфичность АДГ различных классов имеет существенные различия: не каждый фермент может

Таблица 1. Характеристика различных классов АДГ. По АДГ5 данных недостаточно.

В ходе окисления этанола образуется очередное токсичное соединение — ацетальдегид, окисляющийся до уксусной кислоты АЛДГ (НАД+-зависимой ацетальдегиддегидрогеназой), которая в организме представлена цитозольной и митохондриальной изоформами. В меньшей же степени в окислении участвует фермент АО (ФАД-зависимая альдегидоксидаза).

Таким образом, чтобы отследить момент, когда же все-таки наши предки приобрели возможность усваивать этанол, можно посмотреть на филогению видов, в которых присутствовали ферменты АДГ и АЛДГ.

Родословная ферментов

Предковой формой всех АДГ является АДГ3, почти не проявляющая активности относительно этанола. Она есть у позвоночных, беспозвоночных, растений и даже прокариот. АДГ3 дает начало всем остальным АДГ (рис. 2) [4].

Филогенетическое дерево АДГ млекопитающих

Рисунок 2. Филогенетическое дерево АДГ млекопитающих, полученное с помощью алгоритма присоединения соседей. Как видно на рисунке, АДГ1 имеет субкластеры (АДГ1A, АДГ1B, АДГ1C), соответствующие различным субъединицам. Ветвь АДГ4 расположена близко к АДГ1 — предполагается, что она возникла вследствие дупликации гена фермента АДГ1.

Теперь посмотрим, для кого же родным субстратом является этанол, и начнем с первого этапа метаболизма — с АДГ4. Используя гены 28 млекопитающих, включая 17 приматов, исследователи составили  филогенетическое дерево протяженностью около 60 миллионов лет, где разветвления показывали момент изменения последовательности аминокислот в АДГ4.

Последовательности для такого палеогенетического исследования можно брать из публичных баз данных, например, NCBI (National Center for Biotechnology Information) или Ensembl. Также они могут быть получены с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции) с обратной транскрипцией на основе мРНК или геномной ДНК, выделенной из хорошо сохранившейся ткани. Все это использовали авторы рассматриваемой статьи. Далее, чтобы «получить на руки» предковые ферменты и изучить их свойства, нужные гены клонировали в вектор, затем проводили трансформацию, то есть захват полученной плазмиды бактериальной клеткой, в которой затем экспрессировали нужные ферменты. Оказалось, что, несмотря на довольно раннее появление АДГ4 у приматов, активность относительно этанола она приобрела только спустя пару миллионов лет (рис. 3).

Филогения последовательностей АДГ4

Рисунок 3. Филогения последовательностей АДГ4. Вдоль ветвей показаны изменения в последовательности аминокислот, узлы представлены предковыми формами АДГ4. На оси абсцисс отмечено приблизительное время в миллионах лет. Неопределенности в узлах заключены в серые рамки: например, последовательность в узле 44 содержала одну неоднозначность в сайте 117 (апостериорные вероятности для этого сайта составляли 86% для валина и 14% для изолейцина). Все неоднозначные версии наследственных белков были воссозданы, и оказалось, что они имеют сходные кинетические свойства. Синий и красный текст под ветвями — это гомоплазии, общие для линий мадагаскарской руконожки (лат. Daubentonia madagascariensis) и гоминин. Ветви дерева красного цвета указывают на активность ферментов относительно этанола. Ветвь, ведущая к шимпанзе, имеет розовый цвет, говорящий о том, что полиморфизм R38H (замена аргинина на гистидин в 38 положении) является частым среди обыкновенных шимпанзе, и влияние этого полиморфизма неизвестно.

Большая часть наших предков уж точно была трезвенниками. Однако после отделения линии орангутана (лат. Pongo pygmaeus) от линии, ведущей к человеку, ситуация резко изменилась: одна замена аланина на валин в 294 позиции — и АДГ4 становится в целых 40 раз более активным относительно этанола. Кстати, если внимательно посмотреть на картинку выше, то можно заметить, что точно такая же замена есть и у мадагаскарской руконожки ай-ай. Остальных же животных приглашать в бар строго не рекомендуется.

Считается, что закрепление подобной мутации было связано с миоценовым похолоданием, вследствие которого значительно сократились площади тропических лесов и увеличились площади саванн. Это привело к массовому вымиранию подавляющего большинства гоминоидов, однако часть из них перешла к наземному образу жизни, и в их рационе появились забродившие фрукты (рис. 4).

Приблизительное время расхождения приматов

Рисунок 4. Приблизительное время расхождения приматов и увеличение количества фруктов, употребляемых в пищу. My — миллионы лет; NWMs — обезьяны Нового Света; OWMs — обезьяны Старого Света.

Мы разобрались с первым этапом усвоения алкоголя при помощи АДГ4, однако он вносит меньший вклад в метаболизм этанола сравнительно с его биотрансформацией в печени с участием АДГ1.

АДГ1 представлена в организме человека в виде трех субъединиц — альфа, бета и гамма, формирующих гомо- и гетеродимеры, однако так было не всегда. Предполагается, что эти формы возникли вследствие генной дупликации 44–70 миллионов лет назад. Более того, существует гипотеза, что количество генов в кластере АДГ1 зависит от количества употребляемых приматами фруктов (рис. 5) [7].

Филогенетическое дерево происхождения субъединиц АДГ1

Рисунок 5. Филогенетическое дерево происхождения субъединиц АДГ1, построенное с помощью метода максимального правдоподобия. Hu — человек; Bo — бонобо; Ch — шимпанзе; Go — горилла; Or — орангутанг; Ba — бабуин; ROOT — корень.

Несмотря на то, что в этом вопросе еще нет абсолютной определенности, с некоторой долей уверенности можно говорить, что как минимум 10 миллионов лет назад приматы научились метаболизировать этанол, превращая его в ацетальдегид. Что же касается самого ацетальдегида — его биотрансформация в уксусную кислоту была доступна уже очень давно (рис. 6).

Филогенетическое дерево АЛДГ

Рисунок 6. Филогенетическое дерево, построенное с помощью метода присоединения соседей (для построения использовали гены АЛДГ двенадцати людей). Время дивергенции оценивали с помощью алгоритма линеаризации, основанного на аминокислотных последовательностях АЛДГ нескольких видов млекопитающих.

Таким образом, употребление этанолсодержащих продуктов оказывается настолько древним занятием, что теперь каждый человек и даже вышеупомянутый медленный лори может назвать это традицией.

Более того, некоторые животные не только могут метаболизировать этанол, но и предпочитают его большую дозу в пище. В исследованиях медленных лори и мадагаскарской руконожки ай-ай (той самой, сидящей на отдельной филогенетической ветке на рис. 3) слепой рандомизированный эксперимент показал, что, выбирая среди жидкостей, имитирующих нектар, с содержанием этанола от 0 до 5% животные с большей частотой выбирали крепкие напитки (рис. 7).

Мадагаскарские руконожки ай-ай и медленные лори предпочитают более высокие концентрации этанола

Рисунок 7. Гистограмма, показывающая, что мадагаскарские руконожки ай-ай и медленные лори предпочитают более высокие концентрации этанола в жидкостях, имитирующих нектар

Но какую же пользу можно извлечь из изучения всех этих ферментов и кодирующих их генов? Оказывается, внутри самой человеческой популяции не все так однозначно — у некоторых народов ферменты работают несколько иначе, что выливается в довольно занятные для исследования фенотипы.

Все люди разные

Как уже было сказано, для человека характерно пять классов АДГ, и они кодируются семью генами, находящимися на четвертой хромосоме (рис. 8).

Относительный размер и расположение генов семи АДГ на длинном плече четвертой хромосомы

Относительный размер и расположение генов семи АДГ на длинном плече четвертой хромосомы

Рисунок 8. Относительный размер и расположение генов семи АДГ на длинном плече четвертой хромосомы. Показаны в той последовательности, в которой они транскрибируются (стрелки), но противоположно их ориентации на хромосоме. Расстояния между генами показаны в тысячах пар нуклеотидов (килобазах — kb).

Сравнение человеческих геномов показывает частую встречаемость однонуклеотидных полиморфизмов в генах АДГ. Точечная мутация, значимо меняющая аминокислотную последовательность, — и ваш фермент имеет уже иные кинетические характеристики. Например, среди азиатов нередко встречается аллельная форма гена АДГ1В — АДГ1В*2, экспрессия которой формирует уже новую, бета2, субъединицу фермента с заменой на гистидин в 42 положении. А вот для населения Африки характерен аллель АДГ1В*3, кодирующий субъединицу бета3 с заменой на цистеин в положении 370. В обоих случаях это приводит к появлению фермента со значительно бóльшим числом оборотов — примерно в 70–80 раз. Также существуют три аллеля гена АДГ1С (табл. 2).

Таблица 2. Кинетические характеристики разных классов АДГ. Константа Михаэлиса показывает концентрацию этанола, при которой фермент работает на 50% своей «мощности». Число оборотов — количество молекул этанола, которое фермент может превратить в ацетальдегид за одну минуту (при достаточной концентрации этанола). Тре — аминокислота треонин; Арг — аргинин; Гис — гистидин; Цис — цистеин; Иле — изолейцин; Глн — глутамин; Вал — валин. Цифры после трехбуквенного обозначения аминокислоты значат место замены изначальной аминокислоты на неё.

Было установлено, что разные комбинации этих аллелей могут как увеличивать этанолокисляющую способность фермента АДГ1 в несколько раз, так и уменьшать ее на несколько десятков процентов (однако нужно дополнительно учитывать индивидуальные характеристики — уровень экспрессии генов, размер печени и т.д.).

Так, многим известно, что значительная часть восточных азиатов (китайцев, тайваньцев, японцев и корейцев) имеет «непереносимость алкоголя». Это состояние даже называют Asian Flush («азиатский румянец»). Считается, что аллель АДГ1B*2, имеющий высокую встречаемость среди восточных азиатов, препятствует развитию алкоголизма: фермент работает очень быстро, в организме накапливается много ацетальдегида, что приводит к неприятным последствиям, к которым мало кому хотелось бы вернуться. Интересно, что также среди восточных азиатов часто встречается вариант гена АЛДГ2 (кодирует митохондриальную АЛДГ) — АЛДГ2*2, — экспрессия которого ведет к возникновению белка с заменой лизина на глутамин в 504 позиции, в результате чего фермент становится практически неактивным по отношению к ацетальдегиду. Более того, данный аллель является доминантным, следовательно, даже единственный его экземпляр обрекает человека на неприятное похмелье после употребления относительно небольших доз алкоголя (один дринк или меньше) (рис. 9).

Непереносимость алкоголя у молодого азиата (гетерозигота)

Рисунок 9. Непереносимость алкоголя у молодого азиата (гетерозигота). Слева — до употребления алкоголя; справа — после. Другие симптомы включают в себя головокружение, учащенное сердцебиение, головную боль, ухудшение зрения, спутанность сознания.

Кстати, аналогичная реакция возникает при терапии дисульфирамом, лекарственным препаратом, применяемым при лечении алкоголизма. Выступая в качестве ингибитора АЛДГ, он в комбинации с этанолом вызывает острую интоксикацию организма и, соответственно, имеет множество побочных действий вплоть до комы. Конечно, такой серьезный побочный эффект, как кома, может возникнуть только у самых «целеустремленных» пациентов — которые не собираются отказываться от употребления алкоголя, несмотря на лечение. Обычно же отравление дает о себе знать достаточно быстро, что отбивает желание продолжать «торжество». Более того, пациент должен быть проинформирован обо всех рисках, связанных с терапией дисульфирамом, что может полностью отбить желание употреблять алкоголь.

Также есть и более изощренный подход — генная терапия. Если ввести с помощью вирусного вектора в клетки печени больного специфические малые РНК, образующие шпильки (shRNA), произойдет нокдаун гена АЛДГ2. При нокдауне гена путем РНК-интерференции снижается его экспрессия, следовательно, уровень АЛДГ в организме будет очень низким. Предполагается, что генотерапия более эффективна в сравнении с терапией тем же дисульфирамом — симптомы интоксикации будут ярче и отвращение к алкоголю возникнет с более высокой вероятностью. На данный момент такой подход испытан только на клеточной культуре, где отлично себя показал, подавив экспрессию гена АЛДГ2 на целых 90%.

Что делать?

А как же тогда лечить алкоголизм? Ингибирование ферментов приводит к неприятным последствиям, которые могут навредить и так слабому здоровью людей, злоупотребляющих алкоголем.

Можно подойти с другой стороны и посмотреть, что предположительно повышает склонность человека к такого рода зависимостям. Для этого ученые часто ищут варианты генов среди выборки людей с определенным фенотипом, то есть производят полногеномный поиск ассоциаций. Так, выяснили, что главным кандидатом, играющим важную роль в формировании алкогольной зависимости, является OPRM1 — ген мю-опиоидного рецептора. Однонуклеотидный полиморфизм и здесь сыграл свою роль — аффинность бета-эндорфина к этому рецептору возросла в три раза, а также увеличились субъективные эффекты, вызываемые алкоголем.

Таким образом, люди с данным полиморфизмом испытывают большее «удовольствие» от употребления алкоголя и, соответственно, имеют увеличенную вероятность развития алкоголизма. Для терапии в этом направлении в 2010 году на рынок вывели препарат налтрексон — неселективный антагонист опиоидных рецепторов (однако наибольшее сродство он имеет именно к мю-рецепторам). Предполагается, что механизм его действия заключается в подавлении подкрепляющих субъективных эффектов алкоголя. Однако, согласно свежему метаанализу, налтрексон имеет довольно скромный эффект в терапии алкогольной зависимости по сравнению с плацебо: относительный риск  для пациентов вернуться к употреблению какой-либо дозы алкоголя составляет 0,96, в то время как риск возвращения пациента к употреблению больших доз — 0,83. Исследования показывают, что люди с олигонуклеотидным полиморфизмом в гене опиоидного рецептора несколько лучше поддаются лечению.

Относительный риск (relative risk) представляет собой частное от деления экспериментальной вероятности возникновения события (experimental event rate) на вероятность возникновения события в контрольной группе (control event rate). В данном случае мы находим отношение вероятностей возвращения пациента к употреблению алкоголя в экспериментальной группе (той, где производится терапия налтрексоном) и аналогичной вероятности в группе контрольной (там, где участникам дают плацебо).

Другие виды лекарств, связанные с терапией алкоголизма, смотрите в таблице 3:

Таблица 3. Лекарства, одобренные для комплексного лечения алкоголизма (то есть для лечения в сочетании с другими препаратами, включая другие лекарства из этой таблицы, и психотерапией).

Таким образом, сегодня не существует лекарств, обладающих и достаточной эффективностью, и не такими серьезными побочными эффектами. Лечение алкоголизма по большей части заключается в работе над собой самого пациента и поддержке специалистов и окружающих, ведь статистически такой человек часто имеет дополнительные психологические проблемы, например, СДВГ (синдром дефицита внимания и гиперактивности) или большое депрессивное расстройство. Исследования показывают, что психотерапевтические подходы (как медикаментозные, так и немедикаментозные, например, когнитивно-поведенческая психотерапия) показывают клинически значимые результаты в терапии алкогольной зависимости на фоне дополнительных психологических проблем.

Ну, и еще по одной!

Классическая J-образная кривая более низкой смертности умеренно пьющих людей

Классическая J-образная кривая более низкой смертности умеренно пьющих людей

Рисунок 10. Классическая J-образная кривая более низкой смертности умеренно пьющих людей. Считается, что исследования, где получались такие кривые, являются методологически неверными (подробнее в тексте).

Употребление этанола является очень древним и эволюционно обоснованным занятием, однако пить или не пить — вопрос сугубо личный. В принципе, каждый человек может заблаговременно генотипировать себя и решить, стоит ли ему придерживаться описанной многолетней «традиции». Более того, среди людей бытует мнение, что бокал красного вина в день — это чуть ли не обязательная привычка! Однако оно сформировалось на базе не очень чистых с точки зрения методологии исследований. В них говорится о том, что «умеренно пьющие» люди имеют более низкую смертность в сравнении с трезвенниками и с теми, кто пьет алкоголь в больших количествах (рис. 10).

Однако часто оказывается, что так называемые трезвенники являются просто бывшими алкоголиками, а люди, злоупотребляющие алкоголем, поступают так в силу других серьезных заболеваний. Получается, что выборка в исследовании сформирована неверно, и опираться на эти результаты не стоит. При учете всех факторов, которые могут тем или иным образом повлиять на продолжительность жизни исследуемых, не удается воссоздать J-образную кривую — получается предсказуемый график, и умеренно пьющие люди не обладают пониженной смертностью. Так что, как говорится, думайте сами, решайте сами.

Источник: БИОМОЛЕКУЛА

Есть вопрос или комментарий?..


Ваше имя Электронная почта
Получать почтовые уведомления об ответах:

| Примечание. Сообщение появится на сайте после проверки модератором.


Вернуться в раздел Новости

Регистрация ЛСCRO Биоконсалтинг предлагает любые виды услуг по юридическому оформлению лекарственных средств на территории РФ....
Открыть раздел Регистрация ЛС
Подработка для студентов! Участие в медицинских-научных исследованиях. Исследования проводятся в течении 4-х дней (2+2 через 2 недели) (оплата от 3 000 рублей в день)....
Открыть раздел Вакансии
Политика в области качестваОсновная цель деятельности Общество с ограниченной ответственностью «Биоконсалтинг» (далее ООО «Биоконсалтинг») – проведение токсикологических,...
Открыть раздел Политика в области качества
The LineAct Platform