Формирование половых желез млекопитающих определяется не только тем, какие половые хромосомы содержатся в клетках конкретного индивида. Важна васкуляризация — «прорастание» кровеносных сосудов: в семенниках сосуды появляются уже на ранней стадии их развития, а в яичниках этого не происходит. Имеет значение и иннервация гонад. Как показала новая работа американских ученых, которые проводили эксперименты на мышах, при развитии яичников в них из нервного гребня мигрируют предшественники нейронов. В семенниках такие клетки не выявляются. Миграция нервных клеток происходит и в случае реверсии пола, когда прекращается генетически запрограммированное развитие семенников и начинается формирование женских половых желез.
Рис. 1. Образование мужских (Б) и женских (В) половых желез плацентарных млекопитающих из индифферентной гонады (А). При формировании семенников мезонефросы и их протоки сохраняются, а при формировании яичников они утрачиваются и остается только незначительная часть ткани мезонефросов. Поэтому яйцеводы (производные парамезонефрических протоков) не связаны напрямую с яичниками (производными мезонефроса) и созревшие яйцеклетки могут выйти в пространство между этими структурами. Если при этом произойдет оплодотворение, то наступит внематочная беременность.
Семенники и яичники — соответственно, мужские и женские половые железы — уникальны в плане путей развития органы. Они формируются из одного и того же зачатка — индифферентной первичной гонады, а он является частью туловищной почки — мезонефроса (рис. 1). (И мезонефрос, и первичная гонада — парные структуры.) Ее строение не зависит от генетического пола эмбриона (то есть от того, какие половые хромосомы находятся в клетках эмбриона). Но затем ткань внутри этой гонады начинает преобразовываться, прилегающие к ней протоки — тоже, и преобразования эти зависят от концентрации фактора развития семенников (testis determining factor, TDF), чей ген расположен на Y-хромосоме. Если эта молекула вырабатывается в клетках эмбриона (а для этого им надо иметь соответствующую хромосому), из первичной гонады получаются семенники. Если нет — яичники.
Когда путь развития индифферентной гонады определен, в действие вступают и другие факторы. Анатомия яичника и семенника начинает различаться. Основу семенника формирует мозговое вещество первичной половой железы, то есть ее внутренние слои, а в случае яичника это, напротив, наружная ткань (корковая). В семенники начинают прорастать многочисленные кровеносные сосуды. У мышей это происходит на 16,5 сутки после зачатия, а определение судьбы гонад — за 5 суток до этого (всего беременность лабораторной мыши, Mus musculus, длится около 30 дней). Кровеносные сосуды мигрируют в будущий семенник из мезонефроса, и притягивают их туда факторы, запустившие формирование половых желез по мужскому пути. Клетки эндотелия способствуют разделению ткани семенников на четко оформленные семенные канальцы, в которых формируются сперматозоиды.
В яичниках нет таких канальцев. В них вообще довольно мало кровеносных сосудов. То есть они не участвуют в формировании первичных фолликулов, где впоследствии будут дозревать яйцеклетки. Возникает вопрос: что же тогда определяет структуру яичников? Один из кандидатов — нервы. Нервные клетки входят в состав любого органа, они нужны, чтобы подавать ему сигналы и принимать от него «отчеты о работе». Это хорошо известный факт, но иннервацию половых желез, ее изменения в ходе формирования эмбриона, тем не менее, практически не исследовали. Ученые из Медицинской школы Вашингтонского университета и Университета Дьюка занялись этим.
В предшествующих работах иннервацию яичников и семенников изучали на срезах, притом обычно уже сформированных органов. Таким методом невозможно проследить за образованием сосудов в первичной гонаде и продолжением их развития после того, как судьба этой гонады определится в пользу какого-то одного пола. Авторы нового исследования следили за изменением количества и положения нервных клеток еще в первичных гонадах и мезонефросе в целом. Сначала они использовали для этой цели культуры тканей мезонефроса и первичных гонад (ткани брали непосредственно перед тем, как гонада «решит», по какому пути ей развиваться), но поняли, что в такой искусственной системе миграция нервных клеток и сосудов может пойти не так, как в реальном организме. Иннервация яичников в культурах была слабой, вероятно, из-за отсутствия связей с симпатическим стволом — чередой нервных узлов рядом с позвоночником, от которой отходит множество нервов.
Поэтому основной массив данных в итоге собрали при изучении срезов мезонефроса, почек и гонад эмбрионов, сделанных через определенное количество суток после зачатия. Спаривание множества пар мышей постарались синхронизировать. Момент оплодотворения определяли по возникновению вагинальной пробки (Mating plug): считалось, что от зачатия до ее появления проходит 0,5 суток.
Будущие нервные клетки несут в себе специфические молекулы-маркеры, например: TUJ1 (входит в состав микротрубочек нейронов и их предшественников), HuC и HuD (связываются с мРНК и таким образом влияют на ее активность). Иммуногистохимическое исследование — «покраска» срезов флуоресцирующими антителами к соответствующим молекулам — показало, что в срезах надпочечников и почек эмбрионов возрастом 15,5 суток после зачатия TUJ1, HuC и HuD уже имеются. Клетки, содержащие эти маркеры, на этом этапе обнаруживаются в мезонефросах зародышей обоих полов, но в небольших количествах, по две группы в пять-восемь клеток каждая. Они лежат там среди клеток, обладающих маркерами клеток Сертоли (маркер — AMH) в семенниках и зернистых клеток (granulosa cell, маркер — FOXL2) в яичниках. Нервы явно начинают расти в сторону половых желез, но внутри них пока не развиты (рис. 2).
Рис. 2. Распределение нейрональных маркеров TUJ1 (отмечен красным) и HuC, HuD (отмечены зеленым) по гонадам и мезонефросам мышиных эмбрионов в возрасте 15,5 суток (E15.5, embryonic day 15.5). Изображения A, С, C', D — самка (XX), B, E, E', F, F' — самец (XY). Чтобы лучше было видно гонады каждого пола, на A эмбрион показан с дорсальной стороны, на B — с вентральной. Голубым отмечены маркеры типичных клеток половых желез — FOXL2 зернистых клеток яичника и AMH клеток Сертоли семенников. Серым отмечены участки, несущие ДНК (то есть в основном ядра клеток). Пунктиром выделены увеличенные участки (например, E' — изображение области, выделенной белым пунктиром на E). Dorsal — дорсальная, спинная сторона (C, C', E, E'). Ventral — вентральная, брюшная сторона (D, F, F'). Буквами обозначены: o — яичник (ovary), t — семенник (testis), m — мезонефрос (mesonephros), p — таз (pelvis), sc — симпатический ствол (sympathetic chain), k — почка (kidney), a — надпочечник (adrenal gland). Длина масштабных отрезков — 100 мкм.
На 16,5 сутки TUJ1 присутствует в гонадах обоих полов. Однако у самцов он проникает только в придатки яичек и семявыносящие протоки, но не в толщу семенников. А у самок клетки, несущие TUJ1, в тот же день эмбрионального развития обнаруживаются уже и в яичниках. На 18,5 сутки после зачатия картина принципиально не меняется: нейронов и их предшественников в семенниках по-прежнему нет. Непосредственно после рождения и на пятый день жизни они там тоже отсутствуют (рис. 3).
Рис. 3. Распределение нейрональных маркеров TUJ1 (отмечен красным) и HuC, HuD (отмечены зеленым) по гонадам и мезонефросам мышиных эмбрионов в возрасте 16,5 суток (E16.5, embryonic day 16.5), 18,5 суток (E18.5, embryonic day 18.5), а также сразу после рождения (P0, postnatal day 0) и в пятые (P5, postnatal day 5) сутки после него. Первая и третья строки (A, C, E, E'; G, I, I') — срезы тканей самцов, остальные — срезы тканей самок. Видно, что маркер TUJ1 в семенниках и после рождения отсутствует в самой ткани, образующей сперматозоиды, и есть только в канальцах (E', I'). Нервные клетки в яичниках после рождения обнаруживаются и в корковом (cort, cortex), и в мозговом веществе (med, medulla). Буквами обозначены: h — ворота яичника (hilus), e — придаток семенника (epididymis), ed — выносящие протоки (efferent ductules), tt — семенные канальцы (testis tubules), vd — семявыносящий проток (vas deferens). Остальные обозначения — как на рис. 2.
Итак, в сердцевине развивающихся яичников предшественники нейронов есть, а в сердцевине семенников их нет и после рождения. В теории эти клетки могли бы происходить и не из нервного гребня. Чтобы проверить, из какой структуры они мигрировали, использовали трансгенных мышей, экспрессирующих Wnt1-Cre. Работа гена Wnt1 в эмбриональном развитии запускает формирование мозжечка и среднего мозга, определяет границу между задним и средним мозгом и многое другое. Такие трансгенные мыши широко используются для определения судьбы производных нервного гребня. Ген Cre кодирует одноименный белок, важный для рекомбинации, которая нередко происходит в нейронах и после деления их предшественников. Современные методы позволяют менять интенсивность экспрессии этого гена в разных типах клеток независимо. Таким образом, конструкции с Cre, такие как Wnt1-Cre, можно настроить на работу в производных нервного гребня, но «запретить» им проявлять себя в других типах клеток.
Помимо Wnt1-Cre клетки нервного гребня исследованных эмбрионов экспрессировали Rosa-tdTomato. «Rosa» в данном случае, условно говоря, — это место в ДНК, куда внедряется ген красного флуоресцентного белка tdTomato. Клетки с такой активной структурой светятся красным. Получается, что если предшественники нейронов в развивающихся гонадах мышей мигрировали из нервного гребня, то в ткани половых желез зародышей уже на 15,5 сутки будут видны красные области. Так и оказалось (рис. 4).
Рис. 4. Нейроны и их предшественники мигрируют в половые железы из нервного гребня. Фотографии комплексов гонад с органами выделительной системы у эмбрионов трансгенных мышей с Wnt1-Cre, Rosa-tdTomato (Rosa-TdTm на рисунке). Обозначения — как на рис. 2 и 3.
Клетки нервной ткани принципиально делят на две группы: нейроны и нейроглию (глию). Второй в разы больше (по крайней мере, в головном мозге), но при этом она нужна больше для защиты и питания нейронов — клетки самой глии редко генерируют электрические импульсы, и эти импульсы не служат основным «средством общения» ни внутри нервной системы, ни в ее контактах с другими системами и органами. А что с глией в яичниках? Чтобы это выяснить, ученые использовали эмбрионы трансгенных мышей, у которых ген красного флуоресцентного белка мог проявлять себя только в клетках-предшественниках (и их потомках) с маркером глиальных клеток S100b. Такие клетки обнаружились, tdTomato в них флуоресцировал. Они выявлялись и на 17,5 сутки эмбрионального развития, и через 5 дней после рождения. Значит, и глия в яичниках есть, притом уже в начале их формирования.
Еще один важный вопрос: какие факторы вызывают «прорастание» предшественников нейронов и глии в гонаду? Оно явно начинается уже после действия генов, расположенных на половых хромосомах. Здесь снова помогла генетика. Известно, что в эмбрионах мышей с неработающим геном FGF9 не развиваются полноценные семенники, даже если генетически это самцы (XY). Какое-то время гонада может формироваться по мужскому типу, но между 12,5 и 14,5 сутками после оплодотворения происходит реверсия пола (sex reversal), и гонада переходит на путь развития яичника. Изучение срезов почек, мезонефросов и будущих половых желез у самцов-мутантов по FGF9 выявило, что к 17,5 суткам эмбрионального развития их гонады выглядят как яичники, в них вырабатываются те же маркеры, что и в яичниках (в частности, FOXL2), а еще в них из нервного гребня мигрируют предшественники нейронов и глии. Таким образом, «прорастание» нервов в яичники контролируется не хромосомным полом, а какими-то молекулами, присутствующими в гонадах.
Здесь возможно несколько вариантов. Вероятно, какие-то вещества (репелленты) в развивающихся семенниках «отпугивают» предшественников нейронов и глии. Либо, напротив, в формирующихся яичниках находятся молекулы-аттрактанты, «привлекающие» туда обсуждаемые производные нервного гребня. Исследователи измерили экспрессию генов, кодирующих некоторые из молекул-кандидатов на эти роли: репеллентов нейронов и глии Sema3f, Sema6c, Slit1 и ряда аттрактантов тех же клеток. Оказалось, что в яичниках «привлекающие» будущую нервную ткань белки производятся с той же интенсивностью, как и в соседних органах, зато снижена экспрессия генов белков-репеллентов Sema3f, Sema6c и Slit1. Она падает и в бывших семенниках мутантов по FGF9, меняющих пол с мужского на женский. Получается, что гонады самцов вырабатывают белки, не дающие нейронам и глии проникнуть внутрь органа, а гонады самок так не делают.
Вопросов по-прежнему много. Если нервной сети в сердцевине семенников нет, то как там осуществляется координация функций? Почему без нейронов и глии там можно обойтись? Какие клетки берут на себя роль регуляторов? И как нервная ткань, в свою очередь, влияет (или не влияет) на развитие гонад? Эти вопросы относятся к мужским половым железам, и на них сложнее ответить, потому что кандидатов-регуляторов пока много. Чуть более узкий вопрос касается яичников: как составляющие этих органов влияют на их иннервацию на поздних стадиях развития? Все это еще предстоит выяснить, а пока можно составить схему иннервации яичника мышиного эмбриона (рис. 5). Скорее всего, она не сильно отличается от человеческой.
Рис. 5. Схема иннервации развивающегося яичника мыши. Показаны и прилегающие органы: почка (kidney, желтый), симпатический ствол (sympathetic chain, серый), яйцевод (oviduct, серый более темного оттенка). Голубым в яичнике (ovary) показаны зернистые клетки, экспрессирующие FOXL2. Фиолетовые точки — ооциты (oocytes, из них развиваются яйцеклетки). Красные точки — тела нейронов (neural bodies), красные линии — нервные волокна (neural fibers), зеленые линии — кровеносные сосуды (vasculature; не входят в зону, где экспрессируется FOXL2).
Источник: ЭЛЕМЕНТЫ БОЛЬШОЙ НАУКИ
