Для редактирования генома можно использовать систему CRISPR-Cas12b — американские исследователи определили вариант фермента Cas12b, который работает в клетках человека, и усилили его активность с помощью генетической инженерии. Статья опубликована в Nature Communications.
CRISPR-Cas системы — комплексы из коротких РНК, узнающих специфическую последовательность ДНК, и ферментов — эндонуклеаз, которые вносят разрыв эту ДНК. Несколько типов таких систем было описано у бактерий, где Cas ферменты разрезают чужеродную — вирусную ДНК, попавшую в геном хозяина. Вторую систему CRISPR-Cas используют для геномного редактирования.
Три типа ферментов Cas
Самыми широко применяемыми являются системы с эндонуклеазами Cas9 и Cas12a. Существует также система с Cas12b. Этот фермент меньше используемых — его легче ввести в клетки с помощью вирусного вектора. Однако наиболее охарактеризованный AacCas12b из бактерии Alicyclobacillus acidoterrestris и большинство других Cas12b хорошо работают только при температуре 48 градусов Цельсия, поэтому для клеток млекопитающих, живущих при 37 градусах, Cas12b зачастую неприменим.
Американская группа ученых под руководством Фэна Чжана рассмотрела несколько Cas12b и показала, что только BhCas12b из бактерии Bacillus hisashii работает в клетках человека. Далее исследователи заменяли аминокислоты в активном центре фермента, чтобы он был более доступен для нити ДНК. Учитывая, что у многих работающих при 37 градусах ферментов на поверхности есть глициновые остатки, ученые также вводили глицин на поверхность BhCas12b, после чего оценивали эффективность работы полученных вариантов in vitro.
b, замена аминокислот в активном центре BhCas12b (обозначены буквами с номерами); d, замена аминокислот на глицин на поверхности BhCas12b; c, e, влияние замен на эффективность работы фермента (красным обозначены наиболее оптимальные варианты для соответствующей части фермента)
Определив, какие мутации лучше всего действуют на работу BhCas12b, ученые подтвердили эффективность и высокую специфичность связывания мутантного фермента с нужной последовательностью ДНК в клетках человека. Таким образом, BhCas12b можно использовать для редактирования генома.
Источник: N+1
