Методы, позволяющие осуществлять удаление определенного внутриклеточного белка, т.е. белковый нокаут, крайне востребованы как в фундаментальной биологии, так и, в перспективе, в молекулярной медицине. В биомедицинской литературе уже достаточно давно обсуждается возможность использовать для белкового нокаута убиквитин-протеасомную систему (УПС), представляющую собой основной механизм селективной деградации белков в эукариотической клетке.
В рамках данной системы энзиматический каскад, включающий ферменты Е1, E2 и убиквитинлигазу Е3, катализирует присоединение к белкам, подлежащим деградации, полиубиквитиновой цепи определенной структуры. Эта цепь затем узнается протеасомой, которая непосредственно осуществляет деградацию белка-мишени. Воздействуя на данный процесс, теоретически возможно направить на путь деградации отдельные выбранные белки. Так, некоторые вирусы используют различные механизмы для изменения активности УПС в поражаемых клетках в своих целях. Попытки использовать УПС для селективного нокаута белков предпринимались и различными исследовательскими группами, однако до настоящего времени было опубликовано лишь несколько примеров такого подхода, в силу разных причин применимых лишь к небольшому числу белков.
В опубликованной в Journal of Biological Chemistry статье группа исследователей из университета Корнелла под руководством Matthew DeLisa представила оригинальный метод, который претендует на универсальность и может использоваться для элиминации практически любых внутриклеточных белков. Метод основан на «перепрограммировании» УПС с использованием химерных ферментов, осуществляющих убиквитилирование выбранных белков и их направление на путь протеасомной деградации.
Модульно-иерархический принцип организации каскада убиквитилирования позволил достигнуть цели с помощью модификации лишь 1 компонента системы – убиквитинлигазы E3. Основой послужила убиквитинлигаза CHIP. Этот фермент довольно хорошо охарактеризован и отвечает за убиквитилирование большого числа внутриклеточных белков, распознавание которых происходит с участием домена TPR. В описываемом эксперименте этот домен был удален и заменен искусственными конструкциями, которые авторы называют «дизайнерскими связывающими белками» (designer binding proteins, DBP). В качестве таких распознающих белок-субстрат модулей использовались одноцепочечные Fv-фрагменты антител, или Fv-интратела и так называемые монотела, основанные на использовании фибронектиновых доменов III типа. В отличие от обычных антител, интратела и монотела сохраняют активность в денатурирующих условиях и поэтому способны связывать свои «антигены» с высокой специфичностью и аффиностью внутри клетки.
По аналогии с антителами, авторы называют созданные ими химерные белковые конструкции «убиквителами». Для проверки работоспособности метода использовались химеры, включающие интратела к бета-галактозидазе и монотела к мальтоза-связывающему белку MBP. В экспериментах in vivo с использованием котрансфекции белков-мишеней и специфичных к ним убиквител в 3 клеточных линиях авторам удалось продемонстрировать эффективный нокаут выбранных белков. При этом уровень эндогенных субстратов убиквитинлигазы CHIP дикого типа оставался неизменным. Масс-спектрометрические исследования подтвердили, что убиквитела катализировали присоединение к белкам-мишеням именно того типа полиубиквитиновых цепей, который помечает внутриклеточные белки для протеасомной деградации. При этом степень элиминации белка-мишени напрямую зависела от концентрации плазмид, кодирующих убиквитела
Использование предлагаемого метода поможет существенно упростить исследования эффектов полной или частичной элиминации того или иного белка в клетке. Кроме того, данная технология имеет большой потенциал для разработки новых терапевтических подходов, основанных на селективной элиминации аберрантных белков, например, в случае некоторых видов рака и нейродегенеративных заболеваний.
Схема работы УПС в естественных (слева) и в модифицированных (справа) условиях. В первом случае ферменты Е1, Е2 и Е3 катализируют присоединение убиквитина к нативным субстратам (S), которые затем подвергаются деградации в протеасоме. Во втором случае химерный фермент Е3-DBP убиквитилирует заданный белок-мишень (T).
В других исследованиях показано, что N-концевой метионин – сигнал для деградации клеточных белков.
Набор N-концевых сигналов, узнаваемых системами деградации белков, шире, чем считалось ранее. В дополнение к известным сигналам Arg/N- и Ac/N- сильным сигналом деградации оказалась последовательность N-метионин с последующим остатком гидрофобной аминокислоты (Ф). Эффект MetΦ/N-конца как сигнала деградации продемонстрирован как на синтетических олигопептидах, так и на природных белках in vivo.
Правило N-конца для убиквитинилирования и последующей деградации белков было сформулировано группой А. Варшавского в 1986 г. В соответствии с этим правилом компоненты, осуществляющие деградацию (рекогнины), узнают N-концевые сигналы дегадации (дегроны), и осуществляют полиубиквитинилирование белка, что приводит к его расщеплению протеосомами. Некоторые N-концевые аминокислотные остатки (Arg, Lys, His и др.) прямо узнаются рекогнинами, другие (Asn, Gln, Asp и др.) подвергаются дезамидированию, затем аргинилированию и такая форма узнается рекогнинами. Еще один тип модификации для придания свойства узнавания рекогнинами представляет собой ацетилирование N-конца.
В рассматриваемой работе авторы показали, что спектр дегронов шире, чем считалось ранее. Эксперименты проводились на убиквитин-лигазе S. cerevisiae Ubr1, связывающейся с иммобилизованными на фильтре олигопептидами. Оказалось, что рекогнин Ubr1 эффективно связывается с пептидами, в которых за N-концевым метионином следует сильно гидрофобный остаток Leu, Phe, Tyr, Trp или Ile (MetΦ/N пептиды). Аналогичные результаты получены и для мышиных Ubr1 и Ubr2. Определен сайт Ubr1, узнающий дегроны. Неправильно уложенные белки, несущие MetΦ/N дегроны, подвергаются интенсивному расщеплению.
В экспериментах на S. сerevisiaе, дефектных по различным рекогнинам, было показано, что природные белки Msn4, Sry1, Arl3 и Pre5 в клетке могут подвергаться деградации через узнавание их N-концевого метионина.
Специфическое связывание убиквитин-лигазы S. cerevisiae Ubr1 с пептидами MZGSGAWLLP (Z = Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr).
Источник: MOLBIOL.RU
