Рис. 1. Перестройки хромосом при хроническом миелоидном лейкозе: 9-я и 22-я хромосомы обмениваются участками, в результате чего образуется так называемая филадельфийская хромосома, несущая в себе ген белка BCR-ABL.
Созданная американскими исследователями конструкция избирательно уничтожает клетки, содержащие мутантный белок BCR-ABL — специфический фактор развития хронического миелолейкоза (одного из видов рака крови). Конструкция состоит из сенсора (белка Crk), распознающего мутантный белок, и двух каспаз — ферментов апоптоза, или клеточного самоубийства. При взаимодействии конструкции с белком BCR-ABL каспазы сближаются, формируя димер (сдвоенную молекулу). Димеризация каспаз запускает самоубийство клетки, в которой был обнаружен BCR-ABL.
Гибель отдельных клеток зачастую бывает полезна организму в целом — например, когда речь идет о дефектных клетках или о клетках, нужных только на определенном этапе развития организма. С этой целью в каждой клетке может быть запущена программа апоптоза — клеточного самоубийства. При ее реализации активизируются особые ферменты — каспазы, разрушающие клеточные структуры: цитоскелет, белки оболочки ядра, белки межклеточной адгезии. Инициаторные каспазы, запускающие весь каскад разрушений, активируются в ответ на определенные сигналы: сигнал от рецепторов TNFR (рецепторы фактора некроза опухоли), образование значительных количеств активных форм кислорода, увеличение содержания Ca2+ в цитоплазме, нарушение целостности митохондриальной мембраны, серьезные повреждения ДНК, которые представляются неисправимыми. На следующем этапе после запуска апоптоза начинают работать эффекторные каспазы, разрушающие клеточные структуры. Клетка отделяется от соседей и распадается на отдельные фрагменты, которые быстро поглощаются специализированными клетками иммунной системы (например, макрофагами).
Апоптоз, среди прочего, призван защищать организм и от образования раковых клеток. Однако в клетках, которые всё же превратились в раковые, программа апоптоза отключена: клетка уже не готова жертвовать собой ради блага остального организма. Такие клетки уже не реагируют на стимулы, в норме запускающие апоптоз (окислительный стресс, повреждения генома).
Но даже в таких клетках апоптоз можно вызвать искусственно, запустив сразу каспазный каскад. Это можно сделать, например, стимулировав образование димеров инициаторных каспаз — каспаз-8 или 9, с которых начинается каскад (эти ферменты запускают каскад именно после своей димеризации — сдваивания). Если в клетке с признаками (маркерами) злокачественности искусственно вызвать димеризацию инициаторных каспаз, то такая клетка самоустранится, и раковое заболевание не возникнет.
Для реализации этой идеи необходимо найти признак, который появляется только в раковых клетках и гарантированно отсутствует в нормальных. На счастье ученых, такого рода маркеры существуют для целого ряда злокачественных новообразований. Например, это могут быть белки, образовавшиеся в раковых клетках за счет хромосомных перестроек, которые часто возникают в процессе онкогенеза. К таким маркерам относится и появление белка BCR-ABL в клетках костного мозга пациентов с хроническим миелоидным лейкозом — одним из типов рака крови.
Белок BCR-ABL возникает, когда 9-я и 22-я хромосомы обмениваются участками с образованием так называемой филадельфийской хромосомы (рис. 1). В результате этой транслокации совмещаются два гена — BCR и c-ABL, которые в норме находятся на разных хромосомах, и образуется ген белка BCR-ABL. (Понятно, что в нормальных клетках такого гена нет, и, соответственно, нет и белка BCR-ABL.) Белок BCR-ABL — это киназа, то есть фермент, который может фосфорилировать определенные мишени (точнее, это тирозинкиназа — фермент, который может фосфорилировать тирозиновый остаток специфических клеточных белков-мишеней). Появление таких фосфорилированных мишеней запускает сложный каскад изменений, в результате которых происходит злокачественная трансформация (в данном случае приводящая к хроническому миелолейкозу).
В терапевтических целях разработаны ингибиторы белка BCR-ABL, которые действительно эффективно препятствуют переходу клеток в злокачественное состояние (то есть не дают клеткам с мутантным геном производить белок BCR-ABL). К таким ингибиторам относится препарат иматиниб (Imatinib), который используется в клинической практике для лечения миелоидного лейкоза. Но, к сожалению, такие ингибиторы не действуют на стволовые клетки c этой хромосомной перестройкой, а при их делении образуются всё новые и новые дефектные клетки, содержащие BCR-ABL (см.: Corbin A.S., et al., 2011. Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity). Поэтому полностью избавиться от заболевания с помощью ингибиторов BCR-ABL нельзя. Существуют и другие проблемы этого метода: ингибиторы не работают при гиперэкспрессии BCR-ABL (если в клетке по каким-то причинам образуется очень много белка BCR-ABL, допустимой дозы ингибитора может просто не хватить на то, чтобы инактивировать весь белок) и при возникновении мутаций в этом белке.
Группа американских ученых задумалась над тем, как использовать белок BCR-ABL в качестве «черной метки» для клеток, которые подлежат уничтожению (а не просто ингибировать его, чтобы помешать клетке превратиться в раковую). Для этого необходимо было найти способ запуска апоптоза в ответ на появление белка BCR-ABL.
В качестве сенсора, реагирующего на появление белка BCR-ABL, авторы использовали белок Crk — одну из мишеней тирозинкиназы BCR-ABL. Белок Crk является частью нескольких сигнальных путей, по которым BCR-ABL посылает «команды» различным клеточным компонентах о их новом «режиме работы». После того как тирозинкиназа BCR-ABL фосфорилирует остаток тирозина Y221, белок Crk меняет конформацию за счет того, что с фосфорилированным тирозиновым остатком связывается один из доменов этой же белковой молекулы. В результате молекула Crk изгибается и ее концы сближаются друг с другом.
К концам молекулы Crk исследователи прикрепили по молекуле каспазы-8 — одной из каспаз, активирующих процесс апоптоза. Полученную конструкцию авторы назвали «i-Caspase-8». При добавлении такой конструкции в среду, где присутствует BCR-ABL, происходит следующее: BCR-ABL фосфорилирует Crk — среднюю часть молекулы i-Caspase-8. Crk изгибается, концы i-Caspase-8 сближаются друг с другом, за счет чего две каспазы-8 на ее концах подходят друг к другу, формируя димер (рис. 2). Если все эти события произойдут в живой клетке, то димеризация каспаз конструкции запустит каскад активации многих других молекул клеточных каспаз, то есть запустит апоптоз клетки.
Рис. 2. При фосфорилировании остатка тирозина Y221 в белке Crk молекула i-Caspase-8 изменяет конформацию таким образом, что каспазы-8, обозначенные на схеме зелеными овалами, формируют димер.
Действительно, после проверки полученных конструкций на культуре клеток человека, синтезирующих BCR-ABL или другие киназы, ассоциированные с онкогенностью, было показано, что конструкция с высокой эффективностью вызывает гибель лишь тех клеток, в которых образуется BCR-ABL (рис. 3).
Рис. 3. Проверка конструкции i-Caspase-8 на клетках, не экспрессирующих онкопротеинов (Control), экспрессирующих BCR-ABL или экспрессирующих другие онкопротеины — киназы FLT3D835Y и TEL-PDGFRв. Клетки трансфецировали пустым вектором (GFP), вектором, кодирующим i-Caspase-8 (iC8), а также векторами, кодирующими i-Caspase-8 без тирозина Y221 (iC8Y/F) или i-Caspase-8, в которой одна из каспаз не обладала каталитической активностью (iC8C/S). Видно, что значительный процент клеточной гибели достигается лишь в случае трансфекции клеток с BCR-ABL конструкциями, кодирующими полноценный вариант i-Caspase-8.
Особенно важно было проверить, не будет ли фосфорилировать конструкцию белок c-ABL (рис. 4), на основе гена которого при перестройках хромосом образуется ген BCR-ABL. Белок c-ABL присутствует в нормальных клетках, и его мишени для фосфорилирования не так уж сильно отличаются от мишеней белка BCR-ABL (c-ABL тоже является тирозинкиназой). Поэтому если бы оказалось, что нормальный белок c-ABL тоже может фосфорилировать i-Caspase-8, то гибли бы нормальные клетки, содержащие c-ABL. Однако было показано, что этого не происходит, и конструкция селективно запускает клеточную гибели лишь в ответ на появление BCR-ABL.
Рис. 4. Проверка конструкции на способность фосфорилироваться нормальным белком c-ABL. В этом опыте c-ABL активировали через клеточные рецепторы CD3/CD/28, как это и происходит в природе. Видно, что даже среди клеток, где активировали белок c-ABL и где есть конструкция i-Caspase-8, повышенной смертности не наблюдается. Это означает, что нормальный белок c-ABL не фосфорилирует конструкцию или фосфорилирует ее в недостаточных количествах, чтобы начался апоптоз.
Конструкцию также протестировали на смешанной популяции клеток, содержащих (10%) и не содержащих BCR-ABL (90%). Через семь дней после введения конструкции в популяцию в ней практически не осталось клеток, содержащих BCR-ABL.
Примечательно, что конструкция показала хорошие результаты на мышиных стволовых клетках с геном BCR-ABL, на которые плохо действуют ингибиторы белка BCR-ABL (рис. 5).
Рис. 5. Воздействие i-Caspase-8 на мышиные стволовые клетки, синтезирующие белок BCR-ABL, а также на стволовые клетки, несущие в гене BCR-ABL мутации, увеличивающие его устойчивость к ингибиторам. Видно, что для клеток с такими мутациями (справа и слева внизу) даже в случае добавления ингибитора BCL-ABR иматиниба (imatinib) довольно много злокачественных клеток выживает. Однако, при добавлении i-Caspase-8 (iC8) уровень выживших злокачественных клеток в любом случае очень низкий.
При всех достоинствах созданной конструкции пока неясно, как ее можно было бы применить для лечения пациентов. Авторы пишут, что уже в таком виде она может быть полезна для очистки от злокачественных клеток костного мозга, предназначенного для аутотрансплантаций. (Когда костный мозг для трансплантаций берется у самого пациента — аутотрансплантация, — не возникает проблем с тканевой совместимостью. Однако в случае аутотрансплантаций костного мозга после химиотерапии лейкозов зачастую наступают рецидивы именно по причине загрязнения трансплантатов злокачественными клетками.) Совершенствование подобных методик селективного уничтожения злокачественных клеток в смешанных популяциях поможет снизить процент рецидивов после трансплантаций.
Авторы также отмечают, что доказали высокую эффективность конструкций из двух частей — сенсорной, распознающей белок BCR-ABL, и эффекторной, содержащей каспазы, и говорят о возможности создания их модификаций, реагирующих на появление других киназ, вызывающих развитие других неблагоприятных процессов.
Источник: ЭЛЕМЕНТЫ
