Здесь должен находиться великолепный флэш-ролик. Если ролик не видно - установите Flash Player.

Новости

 
10 января 2013 г.
Интересная статья: редактирование генома ips-клеток – новые возможности в генной терапии

Одним из ключевых вопросов генной терапии является создание методов «тонкого» редактирования генома, которые позволяли бы проводить специфические манипуляции с генами прямо в их эндогенных локусах без существенного риска изменений ДНК других локализаций. Подобные методы могли бы стать мощным инструментом, позволяющим проводить коррекцию рецессивных/доминантных мутаций, как в клинических, так и в исследовательских целях. В полной мере к предъявляемым требованиям соответствуют три разрабатываемые в настоящее время технологии.

Эндонуклеаза цинковые пальцы

Эндонуклеазы с цинковыми пальцами представляют собой искусственно созданные белки, состоящие из двух доменов: ДНК-связывающего домена и ДНК-расщепляющего домена. Основой ДНК-связывающего домена являются несколько одинаковых по строению структур, состоящих из аминокислот цистеина и гистидина связаных с ионом цинка. Эта полипептидная цепь имеет характерную вторичную структуру в виде α-спирали и антипарралельного β-слоя, которые выступают над поверхностью белковой глобулы (транскрипционного фактора) в виде «пальца». Вершины пальцев непосредственно контактируют с большой бороздкой ДНК, где они связываются с нуклеотидными триплетами. Один «цинковый палец» со строго определённой последовательностью аминокислот специфичен к определённому триплету нуклеотидных оснований. Изменения в последовательности аминокислот неконсервативной части цепи приводит и к изменению специфичности «цинкового пальца». В состав одного ДНК-связывающего домена цинк-пальцевой эндонуклеазы обычно включают 3 «цинковых пальца», благодаря чему эндонуклеаза связывается со специфической последовательностью ДНК, состоящей из 9 нуклеотидов. Более того, так как эндонуклеаза проявляет свою активность только при димеризации, необходимо, чтобы с ДНК-мишенью взаимодействовали сразу 2 цинк-пальцевой эндонуклеазы (см. рис. №1), которые связываются со специфической последовательностью, состоящей уже из 18 нуклеотидов. Такого количества оснований достаточно для обеспечения высокой специфичности связывания эндонуклеазы с необходимой ДНК-мишенью. Комбинирование «цинковых пальцев» позволяет создавать цинк-пальцевые эндонуклеазы, которые специфично взаимодействует с любой необходимой последовательностью определенного числа нуклеотидов (18 и более).

Рис. 1. Общая схема специфичного связывания двух цинк-пальцевых эндонуклеаз с нативной ДНК. По M.H. Porteus 2005 с изм.

ДНК-расщепляющая часть представляет собой нуклеазный домен рестриктазы FokI. FokI неспецифически «разрезает» ДНК с образованием двунитевых разрывов, но эта активность проявляется только при димеризации нуклеазы. Следовательно, для проявления нуклеазной активности с ДНК-мишенью должны связаться сразу две цинк-пальцевых эндонуклеазы, причем с необходимыми для димеризации ориентацией и расстоянием друг от друга (см. рис. 1).

Таким образом, благодаря ДНК-связывающему домену цинк-пальцевые эндонуклеазы с высокой специфичностью связываются с интересуемой ДНК-мишенью, тогда как благодаря нуклеазному домену, в интересуемой точке возникает двунитевой разрыв ДНК. В ответ на повреждение ДНК закономерно активируются системы репарации. В эукариотических клетках репарация двунитевых разрывов ДНК осуществляется двумя высококонсервативными механизмами: с помощью соединения негомологичных концов (non-homologous end joining, NHEJ) и с помощью гомологичной рекомбинации (homology-directed repair, HDR). В результате NHEJ-репарации происходит быстрое лигирование двух разорванных концов ДНК. При этом ДНК может восстанавливать первоначальную структуру или может происходить выпадение (делеция) или вставка (инсерция) нуклеотидов. Этот процесс может быть использован для «нокаутирования» необходимого гена-мишени (см. рис. 2), так как инсерции и делеции, как правило, приводят к нарушению транскрипции генов. HDR-репарация происходит в присутствии гомологичной ДНК, которая может иметь как эндогенное, так и экзогенное происхождение (например, эписома). При введении цинк-пальцевых эндонуклеаз вместе с экзогенной ДНК (ДНК-донор), имеющей необходимую последовательность нуклеотидов, у части клеток можно ожидать HDR-репарации с участием экзогенной ДНК в виде матрицы. В зависимости от дизайна ДНК-донора можно добиться, например, устранения генетической мутации или наоборот внесения определенной мутации, трансгена и т.д. (см. рис. 2). Таким образом, технология цинк-пальцевых эндонуклеаз позволяет осуществлять «тонкое» редактирование генома.

Рис. 2. Возможные варианты редактирования генома с помощью цинк-пальцевых эндонуклеаз. По F. Urnov 2010 c изм.

Впервые возможность коррекции точечной мутации в нативных локусах клеток человека с помощью цинк-пальцевых эндонуклеаз была продемонстрирована в 2005 году в работе Федора Урнова и соавт., являющихся сотрудниками биотехнологической компании Sangamo BioSciences. В этом исследовании авторы использовали цинк-пальцевые эндонуклеазы, специфически связывающиеся с геном рецептора интерлейкина-2 (IL2R-γ) в области мутации, которая является причиной связанного с X-хромосомой тяжелого комбинированного иммунодефицита. В результате гомологичной рекомбинации между соответствующим локусом и ДНК-донором в 18% клеток линии K562 произошла коррекция одного аллеля гена IL2R-γ, а в 8% клеток сразу двух аллелей. В этих клетках инициировался синтез IL2R-γ.

Развитие технологии позволило инициировать клинические испытания технологии цинк-пальцевых эндонуклеаз для создания высокоспецифичных цитотоксических Т-лимфоцитов для иммунотерапии глиобластомы и для получения гемопоэтических клеток с устойчивым к ВИЧ генотипом, путем удаления в лимфоцитах пациентов рецептора CCR5, с помощью которого вирус проникает в клетки, если эти рецепторы отключить, организм человека начнет сопротивляться инфекции. Разработанная технология поразила своими возможностями научную общественность – в 2008 году редакция The Scientist признала CompoZr (коммерческое название технологии) одним из наиболее выдающихся продуктов года.

Одним из наиболее востребуемых аспектов технологии цинк-пальцевых эндонуклеаз является коррекция генетических дефектов в аутогенных плюрипотентных клетках, например, в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (иПС-клетки). иПС-клетки с отредактированным геномом можно размножить в культуре, подвергнуть дифференцировке и использовать в дальнейшем для исследовательских и клинических целей. Сразу несколько научных групп опубликовали свои работы в Nature, Blood и Stem Cells, в которых доказали принципиальную возможность коррекции мутаций в иПС-клетках с помощью цинк-пальцевых эндонуклеаз.

L. Vallier с соавт. из Кембриджского университета в качестве изучаемой модели выбрали ген антитрипсина (A1AT), мутация которого является причиной наследственного дефицита α-1-антитрипсина, проявляющегося тяжелым поражением легких (эмфизема) и печени (цирроз). Точечная мутация (Z-мутация) приводит к замене аминокислот в 342 позиции, в результате чего синтезируемый белок полимеризуется в цитоплазматическом ретикулуме гепатоцитов. Авторы сконструировали пары цинк-зависимых эндонуклеаз, разрезающих ДНК в области Z-мутации. В качестве ДНК-донора использовалась не имеющая мутации изогенная гомологичная ДНК встроенная в piggyBac-траснпозон. иПС-клетки, у которых происходила коррекция двух аллелей A1AT, подвергали дифференцировке в гепатоцито-подобные клетки. С использованием флюоресценции и ELISA авторы показали отсутствие в этих клетках полимеров мутантного антитрипсина. Более того, гепатоцито-подобные клетки синтезировали и секретировали нормальную мономерную форму этого белка, которая обладала ингибирующей трипсин активностью.

Научные группы L. Cheng из медицинской школы университета Джона Хопкинса и M. Wernig из медицинской школы Стэнфордского университета, в качестве модели выбрали серповидноклеточную анемию. В геноме больных серповидноклеточной анемией оба аллеля бета-глобина представлены βs-формами (βs-мутация). Точечная мутация в 6 кодоне приводит к замена аминокислоты Glu на Val. Это служит причиной образования дефектной формы гемоглобина. Обе научные группы независимо сконструировали пары цинк-зависимых эндонуклеаз, специфично связывающихся с первым экзоном гена бета-глобина и разрезающие ДНК в месте точечной мутации. В качестве ДНК-донора использовались плазмидные векторы с гомологичной ДНК, несущей βA-аллельный вариант гена. иПС-клетки, в которых происходила коррекция гена бета-глобина, подвергали дифференцировке в эритройдном направлении. Полученные клетки экспрессировали βA-варианты бета-глобина.

Таким образом, цинк-пальцевые эндонуклеазы значительно расширяют наши возможности в коррекции генетических заболеваний. Необходимо отметить, что использование этой технологии сопровождается минимальным риском двунитевых разрывов ДНК в других локализациях. Повышение специфичности связывания эндонуклеаз и вовсе сводит эту проблему к нулю. Тем не менее, в техническом плане создание цинк-пальцевых нуклеаз в настоящий момент пока еще представляет собой сложную процедуру, что и ограничивыает широкое применение этой уникальной технологии. Кроме того они не могут применяться для манипуляции со всеми возможными последовательностями ДНК, да, к тому же, сложны и дороги в производстве.

Ферменты-нуклеазы TALEN

Ферменты-нуклеазы TALEN (transcription Activator-Like Effector Nuclease). Это гибридные белки, часть которых взята у бактерий. Бактериальный фрагмент связывается с небольшими фрагментами ДНК; благодаря необычайной изменчивости его можно приспособить для распознавания едва ли не любой ДНК-последовательности. Другой кусок молекулы TALEN — это собственно нуклеаза, которая делает разрезы в ДНК. Нуклеазы TALEN способны специфично определять нужную последовательность ДНК в геноме и вырезать ее. «Метод применения TALEN очень простой, быстрый и не оставляет следов внесения изменений в геном», - говорит Брюс Уайтлоу (Bruce Whitelaw), молекулярный биолог из Института Рослина (Roslin Institute, Великобритания).

В клинике Майо (Рочестер, США) в геном полосатого данио (Danio rerio) был вставлен генетический регулятор, который позволял включать или выключать конкретный ген. То есть с помощью специфичной нуклеазы TALEN был сделан разрез вблизи интересующего учёных гена. Затем в разрез с помощью других ферментов вставили эту регуляторную нуклеотидную последовательность. После чего оставалось лишь нажимать на рычаг, то есть добавлять вещества, которые включали или выключали регулятор. Следует подчеркнуть, что, во-первых, использование TALEN позволяет ввести регуляторную последовательность «под бок» к любому гену, а во-вторых, эту манипуляцию, как показали авторы, можно проводить с целым организмом, а не только с культурой клеток.

Научная группа Уайтлоу использовала ферменты-нуклеазы TALEN для ингибирования в геноме свиньи генов, кодирующих рецепторы липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). В организме, не имеющем этих рецепторных белков, которые участвуют в элиминации из крови ЛПНП с холестерином, накапливается холестерин и развивается атеросклероз. Генетически модифицированных свиней с дефицитом ЛПНП можно использовать при проведении биомедицинских исследований в качестве модели развития атеросклероза.

Свинья, в организме которой были проведены генетические изменения с помощью ферментов-нуклеаз TALEN, является не единственной моделью воспроизведения у животного заболевания сердца человека. Однако примененный метод имеет меньшую стоимость и большую эффективность. «Я преувеличу, если скажу, что теперь свиней и коров можно рассматривать в качестве больших мышей, но мы движемся в этом направлении», - говорит Хайнер Ниманн (Heiner Niemann), биоинженер из Института Генетики Сельскохозяйственных Животных (Institute of Farm Animal Genetics, Германия).

Бактериальная эндонуклеаза Cas9

Исследователи из Массачусетского технологического института и Рокфеллеровского университета разработали новую технику изменения геномов живых клеток путем добавления или удаления генов. Разработчики заявляют, что данная технология позволяет просто и дешево создавать генетически модифицированные организмы.

Новая технология редактирования генома основана на изменении набора бактериальных белков, которые обычно используются для защиты от вирусов. Используя естественный бактериальный белок, который обнаруживает вирусную ДНК, ученые научились создавать комплексы, состоящие из нуклеазы Cas9, связанной с короткими последовательностями РНК. Эти последовательности предназначены для идентификации конкретных мест в геноме, а Cas9, в свою очередь, разрезает цепь ДНК.

Благодаря этому комплексу можно одновременно изменить несколько участков генома и контролировать качество отключения или внедрения определенных генов. Новая методика проще и дешевле существующих. В перспективе это позволит выращивать человеческие ткани с необычными свойствами, например вырабатывающие молекулы лекарства.

Директор компании Биоконсалтинг - Чагин Алексей Сергеевич

Есть вопрос или комментарий?..


Ваше имя Электронная почта
Получать почтовые уведомления об ответах:

| Примечание. Сообщение появится на сайте после проверки модератором.


Вернуться в раздел Новости

Регистрация ЛСCRO Биоконсалтинг предлагает любые виды услуг по юридическому оформлению лекарственных средств на территории РФ....
Открыть раздел Регистрация ЛС
Подработка для студентов! Участие в медицинских-научных исследованиях. Исследования проводятся в течении 4-х дней (2+2 через 2 недели) (оплата от 3 000 рублей в день)....
Открыть раздел Вакансии
Политика в области качестваОсновная цель деятельности Общество с ограниченной ответственностью «Биоконсалтинг» (далее ООО «Биоконсалтинг») – проведение токсикологических,...
Открыть раздел Политика в области качества
The LineAct Platform